kỹ thuật phân tích - sắc ký lỏng cao áp HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (sắc ký lỏng cao áp) là một công cụ mạnh mẽ dùng trong phân tích môi trường. Bài viết này xem xét cách thức thực hiện và sử dụng. (các nguyên tắc tương tự như trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột)

Lưu ý: Bạn cần đọc các trang giới thiệu về sắc ký lớp mỏng. Sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng hoạt động trên nguyên tắc cơ bản giống nhau.

Giới thiệu

Sắc ký lỏng hiệu năng cao về cơ bản là một hình thức cải tiến của sắc ký cột. Thay vì dung môi qua cột dưới lực hấp dẫn, chúng qua cột dưới áp lực cao lên đến 400 lần áp suất khí quyển. Điều này cho phép bạn sử dụng một kích thước hạt nhỏ hơn rất nhiều cho các vật liệu trong cột và một diện tích bề mặt lớn hơn nhiều cho các tương tác giữa các pha và các phân tử được chuyển qua. Điều này cho phép tách biệt các thành phần của hỗn hợp.

Cải tiến lớn trên sắc ký cột khác liên quan đến các phương pháp phát hiện ra chất và hợp chất. Những phương pháp này tự động hóa cao và cực kỳ nhạy cảm.

Các cột và dung môi

Có hai loại được sử dụng trong HPLC tùy thuộc vào sự phân cực tương đối của dung môi và pha tĩnh.

HPLC bình thường

Đây là bản chất chỉ giống như bạn đã đọc về trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột. Mặc dù nó được mô tả là "bình thường" nhưng nó không phải là hình thức được sử dụng phổ biến nhất của HPLC.

Cột được làm đầy với các hạt silica nhỏ xíu, và dung môi không phân cực - hexane, ví dụ. Một cột điển hình có đường kính 4,6 mm (có thể ít hơn), và chiều dài 150-250 mm.

Các hợp chất có cực trong hỗn hợp qua cột sẽ bị giữ trên cột lâu hơn so với các hợp chất không phân cực. Những chất không phân cực do đó sẽ vượt qua cột nhanh hơn.

HPLC đảo

Trong trường hợp này, kích thước cột là như nhau, nhưng silica được thay đổi để làm cho nó không phân cực bằng cách gắn các chuỗi hydrocacbon lên bề mặt của nó - thường là 8 hoặc 18 nguyên tử carbon. Một dung môi cực được sử dụng - ví dụ, một hỗn hợp của nước và rượu như methanol.

Điều đó có nghĩa các phân tử phân cực sẽ đi qua cột một cách nhanh chóng.

Đảo ngược giai đoạn HPLC là hình thức được sử dụng phổ biến nhất của HPLC.

Quá trình

Một chu trình dòng chảy HPLC

Tiêm mẫu

Tiêm mẫu hoàn toàn tự động, và bạn sẽ thể không biết rõ làm thế nào điều này được thực hiện ở mức độ bài giới thiệu này. Bởi vì những áp lực liên quan, nó không giống như trong sắc ký khí (nếu bạn đã nghiên cứu).

Thời gian lưu

Thời gian thực hiện cho một hợp chất đặc biệt đi qua các cột được phát hiện gọi là thời gian lưu giữ của nó. Thời gian này được tính từ thời điểm mẫu được bơm đến thời điểm sắc ký đồ hiển thị độ cao, cao điểm tối đa cho hợp chất. Các hợp chất khác nhau có thời gian lưu khác nhau. Đối với một hợp chất đặc biệt, thời gian lưu giữ sẽ khác nhau tùy thuộc vào:

Áp lực được sử dụng (bởi vì điều đó ảnh hưởng đến tốc độ dòng chảy của dung môi)

Tính chất của pha tĩnh (không chỉ về vật chất nó được làm bằng, nhưng cũng có kích thước hạt)

Thành phần chính xác của dung môi

Nhiệt độ của cột

Điều đó có nghĩa các điều kiện phải được kiểm soát cẩn thận nếu bạn sử dụng thời gian lưu giữ như là một cách xác định các hợp chất.

Detector (đầu dò)

Có một số cách phát hiện khi một chất đã đi qua cột. Một phương pháp phổ biến là dễ dàng để giải thích sử dụng đầu dò tử ngoại.

Nhiều hợp chất hữu cơ hấp thụ ánh sáng tia cực tím bước sóng khác nhau. Nếu bạn có một chùm ánh sáng tia cực tím chiếu sáng qua các dòng chất lỏng đi ra khỏi cột, và một đầu dò tử ngoại ở phía đối diện của dòng, bạn có thể đọc trực tiếp ánh sáng được hấp thụ.

Lượng ánh sáng hấp thụ phụ thuộc vào số lượng của một hợp chất đặc biệt đó đi qua chùm tia vào thời điểm đó.

 Bạn có thể tự hỏi tại sao các dung môi được sử dụng không hấp thụ ánh sáng UV. Chúng có, Tuy nhiên, các hợp chất khác nhau hấp thụ mạnh mẽ nhất ở các bộ phận khác nhau của quang phổ tia cực tím.

Methanol, ví dụ, hấp thụ ở bước sóng dưới 205 nm, và nước dưới 190 nm. Nếu bạn đang sử dụng một hỗn hợp methanol-nước là dung môi, do đó bạn sẽ phải sử dụng một bước sóng lớn hơn 205 nm để tránh đọc sai từ các dung môi.

Giải thích thông số đầu ra từ detector

Đầu ra sẽ được ghi lại như một loạt các đỉnh pick- một trong những đại diện cho mỗi hợp chất trong hỗn hợp đi qua và hấp thụ ánh sáng tia cực tím. Miễn là bạn đã cẩn thận để kiểm soát các điều kiện trên cột, bạn có thể sử dụng thời gian lưu để xác định các hợp chất hiện tại được cung cấp, tất nhiên, bạn (hoặc người khác) đã đo các mẫu chuẩn của các hợp chất khác nhau dưới những điều kiện giống hệt nhau.

Tuy nhiên, bạn cũng có thể sử dụng các đỉnh pick như một cách đo số lượng các hợp chất hiện có. Chúng ta hãy giả sử rằng bạn đang quan tâm đến một hợp chất đặc biệt, X.

Nếu bạn tiêm một dung dịch chứa một lương X tinh khiết vào máy, không chỉ bạn có thể ghi lại thời gian lưu giữ của nó, bạn còn có thể định lượng X qua quan hệ giữa các độ cao của đỉnh pick được hình thành, trên cơ sở đã đo các mẫu chuẩn.

Diện tích đỉnh tỷ lệ thuận với số lượng X đã qua đầu dò, và khu vực này có thể được tính toán tự động bằng máy tính. Các vùng sẽ đo lường được thể hiện bởi màu xanh lá cây trên biểu đồ.

Nếu sự hòa tan của X ít tập trung hơn, diện tích dưới đỉnh sẽ ít hơn - mặc dù thời gian lưu giữ vẫn sẽ là như vậy. Ví dụ: 

Điều này nghĩa là có thể hiệu chỉnh máy tính để có thể phát hiện số lượng của một chất - ngay cả với số lượng rất nhỏ.

Hãy cẩn thận, mặc dù nếu bạn có hai chất khác nhau trong hỗn hợp (X và Y), bạn có thể nói bất cứ điều gì về số lượng tương đối của họ? Không nếu bạn đang sử dụng hấp thụ tia cực tím là phương pháp phát hiện của bạn.  

Trong sơ đồ, diện tích đỉnh cao cho Y là ít hơn cho X. Đó có thể là bởi vì có ít Y hơn X, nhưng nó có thể tốt như nhau bởi vì Y hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng bạn đang sử dụng ít hơn X không. Có thể có số lượng lớn của Y hiện nay, nhưng nếu nó chỉ hấp thụ một cách yếu ớt, nó sẽ chỉ cung cấp cho một đỉnh nhỏ.